2023空中論壇GMP管理規(guī)范：細(xì)胞開發(fā)培養(yǎng)基篇會(huì)議圓滿成功

2月23日，友康生物聯(lián)合權(quán)威媒體生物谷，邀請了行業(yè)資深專家同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細(xì)胞基地GMP實(shí)驗(yàn)室主任賈文文主任和友康生物技術(shù)部總監(jiān)余知翀老師，共同開展了“2023 GMP管理規(guī)范細(xì)胞藥物開發(fā)培養(yǎng)基空中論壇”，會(huì)議取得圓滿成功。

本次線上直播會(huì)議在兩位專家的帶領(lǐng)下，圍繞間充質(zhì)干細(xì)胞的制備質(zhì)檢、規(guī)?；囵B(yǎng)以及GMP級(jí)干細(xì)胞培養(yǎng)基對MSC培養(yǎng)和藥物申報(bào)的影響展開分享與討論，會(huì)議內(nèi)容干貨滿滿，精彩紛呈。以下整理會(huì)議精粹，以饗讀者。

雖然在干細(xì)胞的制備質(zhì)檢以及規(guī)?；囵B(yǎng)這個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)有很多的研究，但是仍然有很多新的理念和想法。眾所周知，干細(xì)胞指的是具有自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞類群。

干細(xì)胞憑借其兩大特性為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療疑難雜癥帶來希望，目前在心血管疾病、退行性疾病、炎癥性疾病和消化系統(tǒng)疾病都已經(jīng)展現(xiàn)出很大優(yōu)勢，可能會(huì)比目前的一些傳統(tǒng)療法得到一個(gè)更讓大家期待的結(jié)果。

間充質(zhì)干細(xì)胞通過旁分泌或者細(xì)胞激素的方式來發(fā)揮作用，這也是間充質(zhì)干細(xì)胞目前在作為藥物申報(bào)時(shí)，它的作用方式的解讀，但是間充質(zhì)干細(xì)胞很難解決功能細(xì)胞替代的這種模式。所以現(xiàn)在除了間充質(zhì)干細(xì)胞報(bào)藥以外，還有一類細(xì)胞就是ESC細(xì)胞和iPSC細(xì)胞分化的這種功能細(xì)胞，那么它完成的任務(wù)就是替代的這種模式。當(dāng)一個(gè)疾病發(fā)生其實(shí)有幾種原因，一種是功能性細(xì)胞受到了損傷，還有一種是微環(huán)境受到了破壞。在解決疾病過程中，有些治療方式是通過間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的方式，有些是通過替代的方式。其實(shí)不管哪種方式，最終的目的都是來解決疾病的治療。--

干細(xì)胞藥物研發(fā)面臨的瓶頸問題目前有這三個(gè)，第一是適應(yīng)癥的選擇，現(xiàn)在我們能夠看到的選擇，大多數(shù)還是參考了國外已經(jīng)按照藥品獲批的一些間充質(zhì)干細(xì)胞的適應(yīng)癥，從治療效果上相對是比較明確的。第二是在細(xì)胞類型方面，間充質(zhì)干細(xì)胞來源有很多，有羊膜、臍帶、脂肪、牙髓等。其實(shí)大量研究發(fā)現(xiàn)，從不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也有差異，而且它的RNA測序數(shù)據(jù)、單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，也會(huì)顯示出組織來源的特異性，由此看來它在治療方面也會(huì)有一定差異。第三個(gè)就是目前首先要考慮的問題，就是間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)?；a(chǎn)，這個(gè)問題如果不解決，那么在臨床研究里很難去做到療效評估的一致性。做過間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的人應(yīng)該都知道，一個(gè)人做細(xì)胞培養(yǎng)最多只能達(dá)到幾個(gè)億的數(shù)量，而且我們在臨床使用前還要對細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，因此就需要大量的細(xì)胞檢測。檢測完再去臨床使用時(shí)，實(shí)際上細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)很少了。

       干細(xì)胞的生產(chǎn)，絕對不是一個(gè)簡單的過程，實(shí)際上它需要一個(gè)完整的體系，要求達(dá)到人員、設(shè)備、用料、方法、環(huán)境、檢測六個(gè)方面的完整性。細(xì)胞的培養(yǎng)本身可能沒有那么復(fù)雜，但是你要把整個(gè)操作記錄下來、有據(jù)可查，這是很困難的一件事情，所以對人員、組織構(gòu)架、職權(quán)的管理，以及培訓(xùn)和考核監(jiān)督等就成了核心，所有的東西都是圍繞著人。設(shè)備問題，對于要把干細(xì)胞作為藥品生產(chǎn)的企業(yè)是比較容易完成的，因?yàn)閹缀跛械脑O(shè)備都有各種證件、校準(zhǔn)和規(guī)范化操作。在物料管理這方面，實(shí)際上科研和臨床研究有很大區(qū)別，在GMP管理體系里，要求相對比較規(guī)范，來確保干細(xì)胞的整個(gè)生產(chǎn)過程，盡可能把風(fēng)險(xiǎn)降到最低。工藝的優(yōu)化、環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量檢測也是干細(xì)胞生產(chǎn)體系中不可缺少的一環(huán)。在整個(gè)過程中，不僅要有紙質(zhì)化的系統(tǒng)，更要形成一套自動(dòng)化管理系統(tǒng)，來保證整個(gè)生產(chǎn)管理體系的完整性。

在間充質(zhì)干細(xì)胞制備過程中有幾個(gè)原則，第一規(guī)范化試劑耗材采購、接受、檢驗(yàn)、貯存、發(fā)放、使用和運(yùn)輸；第二，所有世紀(jì)來源、作用明確，對人體無害，不影響細(xì)胞生物學(xué)活性；第三，不實(shí)用動(dòng)物源性成分；第四，培養(yǎng)基添加物應(yīng)為臨床藥品及產(chǎn)品；第五，制備區(qū)內(nèi)設(shè)備定期進(jìn)行質(zhì)量管理評估、維護(hù)；第六，定期維護(hù)和管理設(shè)備、試劑和耗材。

間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方式有很多，比如傳統(tǒng)2D、多層2D、多層固定床、3D微載體等方式，各有各的優(yōu)勢。間充質(zhì)干細(xì)胞通過規(guī)模化擴(kuò)增出來以后，接下來就是要去按照藥品流程走。在質(zhì)量體系評價(jià)里面，我們要考慮的就是安全性和有效性。因?yàn)榧?xì)胞的類型不一樣，它可能檢測的內(nèi)容也不太一樣，在所有的檢測方法里面，要注意就是所有的這些檢測一定要按照要求去做準(zhǔn)確性、精密度、耐用性、線性范圍、專屬性和檢測限度和定量限度等，來證明你的檢測方法出的報(bào)告是真實(shí)可信的。

2022年是我國干細(xì)胞行業(yè)令人欣喜的一年，國家和很多地方性政府都頒布了一些行業(yè)政策，發(fā)表了指導(dǎo)性意見，規(guī)范了行業(yè)的發(fā)展。不光是在國家政策方面，還有產(chǎn)品方面，也取得了很多突破。其中友康生物的一套干細(xì)胞原代傳代培養(yǎng)基產(chǎn)品也取得了非常令人欣喜的成果，通過了IND申報(bào)。

結(jié)合之前客戶的經(jīng)驗(yàn)，我們捋出了一個(gè)與培養(yǎng)基相關(guān)的在MSC新藥前期研發(fā)的大致流程。培養(yǎng)基現(xiàn)在大體是按照生產(chǎn)原料來監(jiān)管，但是它實(shí)際上比原料更關(guān)鍵，這是干細(xì)胞藥物開發(fā)的一個(gè)難點(diǎn)區(qū)域。在之前的申報(bào)過程中，我們逐步發(fā)現(xiàn)有五大方面的新藥研發(fā)流程中培養(yǎng)基都起到了關(guān)鍵性作用。首先在細(xì)胞庫的建立中，培養(yǎng)基的性能是否和凍存液匹配、凍存復(fù)蘇后的性能、細(xì)胞種子庫的指控標(biāo)準(zhǔn)以及細(xì)胞性能是否符合適應(yīng)癥要求，都與培養(yǎng)基相關(guān)。其次，在中試開發(fā)方面，培養(yǎng)基是否支持大規(guī)模培養(yǎng)、檢驗(yàn)學(xué)是否能通過正常驗(yàn)評、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立都會(huì)圍繞著培養(yǎng)基性能展開。第三，在藥物安全性評價(jià)中，培養(yǎng)基組分的安全性、必要性、毒性以及、殘留物檢測，也是至關(guān)重要的。第四，在藥效學(xué)上培養(yǎng)基所生產(chǎn)的MSC是否能夠滿足藥效，改善的空間如何。最后，在早期臨床試驗(yàn)中，臨床安全性、有效性評價(jià)，以及培養(yǎng)基的廠家是否支持下游公司的一個(gè)聯(lián)合評審。這是現(xiàn)在大家普遍經(jīng)歷的申報(bào)流程。

     根據(jù)之前的經(jīng)驗(yàn)，友康生物成功開發(fā)出了一個(gè)化學(xué)成分完全明確的GMP級(jí)間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，用于更好地協(xié)助下游的藥物申報(bào)客戶進(jìn)行報(bào)藥。首先這款產(chǎn)品是一個(gè)化學(xué)成分完全明確、在B+A級(jí)的GMP無菌灌裝生產(chǎn)線上生產(chǎn)的一個(gè)新品培養(yǎng)基，它的蛋白種類不超過20種，總含量低于1.5mg/ml，并且無人源、無動(dòng)物源成分，所添加的蛋白全部為人工重組蛋白，目前已經(jīng)獲得美國FDA DMF的備案。其次，這款培養(yǎng)基解決了更換培養(yǎng)基的問題，一款產(chǎn)品無需更換即可實(shí)現(xiàn)原代及傳代的培養(yǎng)。第三，適合細(xì)胞產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)，以及3D的培養(yǎng)體系，達(dá)到了貼壁能力和細(xì)胞性能的平衡。

我們在建立細(xì)胞庫的過程中，不光是培養(yǎng)基要求GMP級(jí)，所使用的凍存液也要求使用GMP級(jí)凍存液來實(shí)現(xiàn)報(bào)藥過程中細(xì)胞庫建立的真正安全，因?yàn)榇蠹叶疾幌胗袀鹘y(tǒng)凍存液中DMSO的殘留。友康生物同時(shí)也開發(fā)出了一款搭配GMP級(jí)培養(yǎng)基使用的GMP級(jí)玻璃化凍存液，它沒有添加血清，沒有添加任何蛋白，也沒有添加DMSO，所有成分完全明確，同時(shí)這款凍存液也獲得了DMF的備案。此外這款產(chǎn)品使用了玻璃化凍存技術(shù)，不用做程序降溫，可以直接投放至-80℃，保存12小時(shí)后即可轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期凍存。第三，由于這款凍存液沒有添加蛋白，所以它可以常溫運(yùn)輸保存，運(yùn)輸存放成本大大降低。

這款GMP級(jí)培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)勢體現(xiàn)在這四個(gè)方面。首先，無血清以及化學(xué)成分明確體系養(yǎng)出來的細(xì)胞形態(tài)更加立體，短梭形更加明顯，這是因?yàn)榻M分篩選所導(dǎo)致的，培養(yǎng)基里所有組分對細(xì)胞有益，所以它的形態(tài)學(xué)更加立體。第二，細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)隨著代次增加仍然維持著一個(gè)比較高的水平，細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的老化。第三，細(xì)胞的表面標(biāo)志物的鑒定結(jié)果很好，陰性標(biāo)志物是一些血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的免疫標(biāo)志物，由于干細(xì)胞免疫源性低，所以它不表達(dá)這些陰性標(biāo)志物，其鑒定結(jié)果一定不超過2%。陽性標(biāo)志物中比較核心的是CD90和CD105，這款GMP級(jí)培養(yǎng)基在P11代次的表面標(biāo)志物鑒定中所有的陰性標(biāo)志物都在0.5%以下，所有陽性標(biāo)志物都在99%以上，在P11代次都達(dá)到了這么好的一個(gè)效果，更何況低代次的細(xì)胞，由此看來可以說這款GMP級(jí)培養(yǎng)基完美達(dá)到了細(xì)胞鑒定的需求。第四，三系分化效果非常明顯，這款GMP級(jí)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)胞染色率都非常的漂亮。

這款GMP級(jí)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的間充質(zhì)干細(xì)胞在質(zhì)量檢測中也有很好的表現(xiàn)。通過淋巴細(xì)胞的增殖抑制檢驗(yàn)，它能夠達(dá)到53.18%的抑制率，對TH1的抑制率達(dá)到了89.96%，對T17的抑制率達(dá)到了46.90%，對于Treg的達(dá)到了24.58%。這些數(shù)據(jù)我們沒有進(jìn)行任何的干預(yù)，很客觀的反饋了干細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)性的作用。

以上就是友康針對該產(chǎn)品的所進(jìn)行的一些細(xì)胞檢驗(yàn)學(xué)的工藝，更新的一些檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們也會(huì)持續(xù)發(fā)布。

精彩問答

Q1：對于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞檢測學(xué)中對于培養(yǎng)基的殘留是檢測哪些物質(zhì)的殘留？

A1：根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，目前在細(xì)胞檢測學(xué)中對于培養(yǎng)基的殘留普遍就是檢測BSA（牛血清白蛋白）和抗生素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的檢測，目前我們已經(jīng)申報(bào)成功的客戶普遍都是檢測這三種物質(zhì)殘留。

Q2：細(xì)胞凍存液中添加DMSO，經(jīng)過凍存的細(xì)胞最后作用于人體，會(huì)對人的安全性有影響嗎？怎么盡可能減小這種危害？

A2：因?yàn)镈MSO作為傳統(tǒng)凍存液中必要的添加物質(zhì)，它殘留于這個(gè)體系中，它本身對細(xì)胞有毒性，所以在經(jīng)過凍存復(fù)蘇工藝的細(xì)胞，需要有一個(gè)非?？焖俚牟僮鳌Ｆ浯尉褪俏覀冏罱K想要達(dá)到的一個(gè)目的是在細(xì)胞復(fù)蘇之后，可以直接制備成制劑，然后回到人的體內(nèi)，所以說我們肯定也是不希望添加DMSO的。現(xiàn)在對于目前傳統(tǒng)的添加了DMSO的凍存液，我們對于復(fù)蘇的細(xì)胞還需要一個(gè)三步清洗來制備成制劑的操作。此外，DMSO從冷凍到常溫的過程中本身會(huì)放熱，所以說理論上對于傳統(tǒng)的凍存液需要在冰上有一個(gè)預(yù)冷的操作，這些操作非常麻煩，這也是大家不希望細(xì)胞凍存液中有DMSO。

Q3：凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇之后可以直接用于人體嗎？

A3：目前來看這種方式是可行的，因?yàn)槲覀兊倪@款GMP級(jí)凍存液中沒有人白蛋白、沒有DMSO，并且細(xì)胞凍存復(fù)蘇的工藝很穩(wěn)定，能保持一個(gè)很好的細(xì)胞活率，是可以穩(wěn)定制成制劑的。我們說的三步清洗的步驟主要是考慮到目前市面上還存在的含有DMSO的凍存液來考慮的，對于我們這款GMP級(jí)凍存液是可以直接制備成制劑的。