窺尋友康GMP級玻璃化細(xì)胞凍存液，淺談細(xì)胞凍存技術(shù)——細(xì)胞凍存技術(shù)發(fā)展史

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著細(xì)胞治療技術(shù)的興起，細(xì)胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇這一基礎(chǔ)技術(shù)日益得到重視。細(xì)胞凍存是細(xì)胞培養(yǎng)中常見而又非常重要的工作，就像農(nóng)民種地留種子一樣，我們需要把狀態(tài)最好的細(xì)胞留存下來，以保證將來有源源不斷的種子用于培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存就是指利用凍存技術(shù)，將細(xì)胞置于低溫保存，使細(xì)胞處于短暫脫離生長的狀態(tài)，從而保留其生物學(xué)有效性，以供后續(xù)實驗或臨床使用，并且方便運輸。

在本系列文章中，我們將從細(xì)胞凍存技術(shù)發(fā)展史、傳統(tǒng)凍存方法及其安全性、玻璃化凍存技術(shù)的優(yōu)勢等方面展開討論，充分展現(xiàn)友康開發(fā)的GMP級玻璃化細(xì)胞凍存液的出色性能，以及它在臨床應(yīng)用和藥物申報方面的安全性。

一、細(xì)胞凍存技術(shù)發(fā)展史

1、1776年，Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對“細(xì)胞”生命活動影響的報道。

2、19世紀(jì)中后葉，許多早期的工作者(Prevost，1840;de Quatrefages，1853;Mantegazza，1866;Scheuk，1870)重復(fù)研究了低溫處理對精子活動的影響，得出了和 Spallanzani相似的結(jié)論。即“冷不能殺死精子”。

3、1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成份能夠在零下溫度儲存的事實。

4、20世紀(jì)50年代，Luyet等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對儲存細(xì)胞的損傷作用，他們的基本結(jié)論是：電解質(zhì)濃度增大是造成儲存細(xì)胞損傷的主要原因。

5、60年代，美國紐約血液中心Rowe實現(xiàn)了紅細(xì)胞的低溫保存。1980年，他將在液氮溫度下保存了12年的紅細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行檢查，沒有發(fā)現(xiàn)任何生化和功能上的變異，從而從實踐上證明了生物材料可以在低溫下長期存活。

6、70年代，Mazur等首先根據(jù)中國倉鼠組織培養(yǎng)細(xì)胞的低溫保存實驗數(shù)據(jù)分析，提出關(guān)于冷凍損傷的兩因素假說目，即冰晶損傷和溶液損傷假說。

7、80年代以來，理學(xué)和工程學(xué)進(jìn)入低溫保存研究領(lǐng)域，低溫工程理論及實用設(shè)計原理的不斷更新及應(yīng)用，低溫生物學(xué)的研究快速發(fā)展。

8、1985年，Rail和Fahy用某種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功，是這種技術(shù)走向?qū)嵱没氖状瓮黄啤?/p>

20世紀(jì)以來，人類的科學(xué)研究進(jìn)入細(xì)胞水平階段，開始對生物和作為食品原料的生物材料進(jìn)行低溫保存處理。到了20世紀(jì)末，隨著科學(xué)方法的不斷進(jìn)步以及冷凍方法的不斷完善，低溫保存技術(shù)廣泛的應(yīng)用到了臨床上。

二、凍存保護(hù)劑——防止細(xì)胞凍傷

 凍存細(xì)胞，不能“一放了之”。因為水在低于零度的條件下會結(jié)冰，將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度降低，細(xì)胞外部的水分會首先結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡；未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，因此復(fù)溫時大量水分會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。

因此，在細(xì)胞凍存時需要在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。冷凍保護(hù)劑易與溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過改變未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度降低其滲透壓摩爾濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷。

1949年，Polge等發(fā)現(xiàn)，甘油對低溫下儲存的細(xì)胞具有保護(hù)作用。1950年smith AU第一次成功利用甘油凍存了紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了凍存保護(hù)劑是影響凍存效果的一個關(guān)鍵因素。1949 ~ 1960年這一段時間可稱為冷凍保存的“甘油時期”，該時期對生物材料的冷凍保存一般均是以甘油作為保護(hù)劑。1959年，Lovelock等發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是人們熟知并一直沿用至今的二甲基亞砜（DMSO）。

實驗室常用的細(xì)胞凍存保護(hù)液配方是10%二甲基亞砜（DMSO）+ 90%胎牛血清（FBS），通用性好，細(xì)胞保護(hù)效果好，受到了廣泛認(rèn)可。但是目前并沒有藥用注射級別的 DMSO 產(chǎn)品，此外該配方中含有動物來源的FBS，有無法消除的安全隱患，是否能直接應(yīng)用于臨床還是值得探究的問題。

本期文章中，我們談到了細(xì)胞凍存技術(shù)的發(fā)展史和凍存保護(hù)劑出現(xiàn)的必要性，還簡單提及常用細(xì)胞凍存保護(hù)液配方。在下一篇文章中，我們將詳細(xì)展開關(guān)于目前常用細(xì)胞凍存液應(yīng)用于臨床的安全性問題。