科普頻道|從“細(xì)胞垃圾”到明日之星，一文了解外泌體的“逆襲之路”

外泌體是一類由活細(xì)胞主動(dòng)分泌、直徑為 30~150 nm、具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡。外泌體的膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，其內(nèi)容物包括DNA、RNA、mRNA、脂質(zhì)、代謝物、細(xì)胞質(zhì)和蛋白質(zhì)等多種生物分子。其中，細(xì)胞膜常規(guī)的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81等）、熱休克蛋白70（Hsc70）、溶酶體蛋白（Lamp2b）、腫瘤敏感基因101（Tsg101）、融合蛋白（CD9、flotillin，annexin）等蛋白在外泌體中的濃度較高，可作為外泌體鑒定的生物標(biāo)志物。

外泌體的來源廣泛，幾乎所有類型的動(dòng)物細(xì)胞都能分泌外泌體，包括免疫細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、癌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等，廣泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁、膽汁等各種體液中。

外泌體的形成主要包括起始（膜形成）、內(nèi)吞作用、多囊泡體（MVBs）的形成和分選（分泌/降解/再循環(huán)）四個(gè)階段。從質(zhì)膜內(nèi)陷和形成包含細(xì)胞表面蛋白和可溶性細(xì)胞外蛋白的早期分選內(nèi)體 （ESE） 開始，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)和線粒體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)也可能導(dǎo)致 ESE 成熟為晚排序內(nèi)體 （LSE）。LSE 的第二次內(nèi)陷產(chǎn)生具有細(xì)胞質(zhì)成分和蛋白質(zhì)的腔內(nèi)囊泡 （ILV）。隨后，LSE 通過內(nèi)陷產(chǎn)生含有 ILV 的細(xì)胞間多泡體 （MVB）。MVB 可以通過細(xì)胞骨架和微管網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，并停靠在質(zhì)膜的管腔側(cè)，然后進(jìn)行胞吐作用。當(dāng)含有多種內(nèi)容物的外泌體釋放到細(xì)胞外后，在組織液中移動(dòng)到鄰近的靶細(xì)胞，或在循環(huán)中移動(dòng)到遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞，并通過以下幾種途徑將信號(hào)傳遞給靶細(xì)胞：

①通過表面結(jié)合配體直接刺激靶細(xì)胞；

②活化受體向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移；

③通過傳遞功能蛋白、脂質(zhì)和RNA對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行表觀遺傳重編程。

目前可通過 GMP 級(jí)大規(guī)模生產(chǎn)獲得的動(dòng)物來源外泌體主要包括：骨髓 MSC 外泌體、脂肪 MSC 外泌體、樹突狀細(xì)胞外泌體、 HEK293 細(xì)胞外泌體等。為了在研究和臨床中更加有效地利用外泌體，從生物樣品中精確地將外泌體分離出來至關(guān)重要。外泌體的分離和富集主要通過差速超速離心、密度梯度超速離心、過濾、超濾、超濾與超速離心結(jié)合、試劑盒提取等傳統(tǒng)方法；此外，微珠、微流控芯片和熱泳技術(shù)等新技術(shù)的應(yīng)用也使得外泌體能夠更加快速、方便地富集。

那么分離富集之后，我們又該如何鑒定提取出來的物質(zhì)是外泌體呢？

1） 外泌體蛋白分析（Western Blot）

采用抗原抗體特異性相結(jié)合的原理，可以鑒定外泌體中存在的特定蛋白，能證實(shí)外泌體成分的存在，其中，CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、HSP90、ALIX等是最常用到的外泌體標(biāo)志物。

2）外泌體形態(tài)和粒徑分布分析

透射電子顯微鏡（TEM）被認(rèn)為是識(shí)別和表征單個(gè)外泌體的常用方法，可以直觀地觀察外泌體形態(tài)和大小。TEM視野下，外泌體呈圓形或杯狀結(jié)構(gòu)，大小范圍為30-150nm。

納米顆粒跟蹤分析（NTA）是一種廣泛用于確定外泌體濃度和尺寸分布的方法。通過光學(xué)原理感知粒子的存在，可以從整體上對(duì)外泌體數(shù)量和直徑的群體特征進(jìn)行檢測，外泌體的粒徑分布區(qū)間在30-150nm。

外泌體作為天然的藥物遞送載體，具有比現(xiàn)有靶向治療的藥物載體更好的穩(wěn)定性和生物相容性。可通過基因工程和化學(xué)修飾來提高藥物靶向細(xì)胞或器官的能力，從而限制藥物對(duì)正常組織和細(xì)胞的傷害，減輕藥物毒副作用。

外泌體載藥技術(shù)分為兩類：外源性載藥技術(shù)和內(nèi)源性載藥技術(shù)。外源性載藥技術(shù)是從細(xì)胞培養(yǎng)液或其他生物體液中分離和純化外泌體，并通過物理或化學(xué)手段將所需藥物負(fù)載至外泌體表面或內(nèi)部；而內(nèi)源性載藥技術(shù)是通過生物工程技術(shù)改造的方式使供體細(xì)胞產(chǎn)生包含特定藥物的外泌體。

通過不同的載藥方式，外泌體可以負(fù)載不同的藥物，通過與源細(xì)胞特殊的親和作用、歸巢效應(yīng)等自然趨向作用，將負(fù)載的藥物運(yùn)送到靶向組織。而在外泌體中加載其他藥物，或者進(jìn)行工程化修飾，能賦予它們對(duì)特定組織、受體細(xì)胞的選擇性，改變體內(nèi)分布，實(shí)現(xiàn)更高效的藥物靶向遞送，從而提高治療效果。

由于外泌體具有脂質(zhì)雙分子層的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，即使在惡劣的腫瘤微環(huán)境下也能夠穩(wěn)定循環(huán)，而且體液中包含大量外泌體，其攜帶的內(nèi)容物能夠反映親本細(xì)胞的生理病理特征。因此外泌體成為液體活檢中最具潛力的新型生物標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道，外泌體蛋白和外泌體RNA均可成為癌癥早期診斷標(biāo)志物：

如腦脊液外泌體中的miRNA包括let-7f-5p、miR-27a-3p、miR-125a-5p、miR-151a-3p和miR-423-5p可作為生物標(biāo)志物用于帕金森病的早期診斷，從分子水平發(fā)揮疾病診斷的精確作用；血清外泌體中的miR-155與肝硬化的進(jìn)展和肝硬化的臨床預(yù)后指標(biāo)密切相關(guān)，表明富含miR-155的外泌體可作為肝纖維化診斷和進(jìn)展的非侵入性生物標(biāo)志物；此外，外泌體miRNA-10b是胰腺癌進(jìn)展相關(guān)的公認(rèn)指標(biāo)之一，廣泛用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早期診斷。在非小細(xì)胞肺癌中，其患者和健康者之間血液中外泌體miRNA-21、miRNA-378、miRNA-139和miRNA-200存在差異表達(dá)，也為早期診斷提供了更多可選的生物標(biāo)記物。

外泌體在治療多種疾病方面顯示出巨大潛力，以外泌體為代表的無細(xì)胞療法極大地?cái)U(kuò)展了包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的治療方法。

據(jù)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可以直接遞送功能性蛋白和 RNA，例如 miRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白并降低細(xì)胞化療耐藥性。來自免疫細(xì)胞的外泌體也可以直接殺死腫瘤細(xì)胞。已知 NK 細(xì)胞通過裂解顆粒中的細(xì)胞毒性物質(zhì)來發(fā)揮細(xì)胞毒性，其表面的跨膜蛋白 Fasl 決定了靶細(xì)胞的命運(yùn)。與 NK 細(xì)胞相比，NK 細(xì)胞的外泌體富集更多的 Fasl 和穿孔素蛋白，并且具有更強(qiáng)的殺死腫瘤細(xì)胞的能力。在心血管疾病的研究中，由間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體遞送的生物活性分子（如 microRNA-132）可促進(jìn)心肌梗死中的血管生成。外泌體可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖和修復(fù)，也可以改善小鼠的心臟功能。

友康推出以“外泌體專用培養(yǎng)基+間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體增強(qiáng)劑+多孔空心微載體”為基礎(chǔ)的干細(xì)胞外泌體大規(guī)模增產(chǎn)方案。通過大量的實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，該方案可以大幅提高外泌體的產(chǎn)量，增加可溶性細(xì)胞囊泡顆粒濃度。