深挖友康NK無血清培養(yǎng)基——細(xì)胞功能檢測(cè)第三彈

上期文章我們展示了使用友康純因子無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的NK細(xì)胞的脫顆粒能力，NK細(xì)胞脫顆粒能力可以用CD107a的表達(dá)來檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同的效靶比下，CD107a均能夠正常表達(dá)。隨著NK與K562細(xì)胞孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，CD107a的表達(dá)量有明顯上調(diào)。

樣本一：孵育2h

樣本二：孵育4h

本期我們通過LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷能力。細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有LDH，正常情況下LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。LDH 可使乳酸鋰脫氫，進(jìn)而使NAD+還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H＋被還原成紫紅色甲月贊類化合物，在酶標(biāo)儀上用490nm比色測(cè)定。其反應(yīng)原理如下：

檢測(cè)步驟

1. 靶細(xì)胞K562的準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前用無血清培養(yǎng)基清洗1次，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度并接種于孔板。

2. 效應(yīng)細(xì)胞的準(zhǔn)備：應(yīng)用前用無血清培養(yǎng)基清洗1次，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度。

3. NK細(xì)胞活性檢測(cè)：取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞按不同效靶比進(jìn)行接種，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，于37度，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。隨后將細(xì)胞在孔板中400g離心5min。LDH釋放劑的添加為原體積的10%，加入釋放劑后反復(fù)吹打細(xì)胞。

4. 分別取各孔上清液120ul，加入到新的96孔平底板種，每孔加入LDH檢測(cè)工作液。

5. 混勻，室溫25℃避光孵育30min。然后在490nm處測(cè)定吸光度?？墒褂?00nm或大于600nm的任意波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

NK細(xì)胞活性（%）=[（反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD）/（最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)]*100%

檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)論

經(jīng)LDH法檢測(cè)可知，友康純因子無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞有正常的殺傷能力。