2023-02-14
行業(yè)熱點RNA提取步驟如下：
1、準備10ml離心管，121℃滅菌20min，烘箱烘干5h，將管道烘干備用；
2、將研缽、研棒、勺子用錫紙包好，200℃烘箱烘干4-6小時，取出烘干的研缽等冷卻；
3、將CTAB提取液放入65℃水浴鍋中加熱開水浴鍋65℃；
4、取出10ml離心管，每管加入4mlCTAB溶液，加入80微升基乙醇(2%)，編號，每個樣品兩管提取液；
5、將樣品加熱到65℃，取出研缽開始準備磨樣；
6、磨好的樣品每管加1g左右，在漩渦儀上混合均勻(可長一點)；
7、一組樣品磨好后，再漩渦一次，將5分鐘放入65℃水浴鍋中。;
8、每管加4ml氯仿：異戊醇（v:v=24:1)在漩渦儀上混合均勻；
9、15℃，10000rpm，10min；
10、將上清液吸入新管中，加入4ml氯仿/異戊醇，在漩渦儀上混合均勻；
11、15℃，10000rpm，10min；
12、吸上清液(盡量不吸多，保證RNA質(zhì)量)，兩管合一管；
13、加1/5體積的12M氯化鋰；1/4體積的10M氯化鋰。
14、放置4℃冰箱過夜，>12小時
15、第二天，開離心機預冷4℃，開65℃水浴鍋，加熱SSTE65℃；
16、4℃，10000rpm，30min；
17、將上清液倒掉，輕輕吸出殘留的上清液，加入400微升的SSTE；
18、在1.5ml離心管中反復吸氣，將液體吸出；
19、在旋渦儀上加入400微升氯仿/異戊醇；
20、10000rpm，5min；(4℃)
21、將上清液吸出，加入新的1.5ml離心管，加入2倍-20℃放置的無水乙醇；
22、上下顛倒混合均勻，-70℃放置30分鐘；打開4℃預冷的小離心機，到電泳室做膠；
23、取出-70℃樣品；
24、4℃，10000rpm，20min；
25、將上清液倒掉，在離心機中甩掉；
26、吸出殘留液體；
27、將沉淀物放在通風柜上晾干；
28、打開紫外線分光光度計，調(diào)整到RNA測試方法；
29、DEPC水溶解沉淀，每管加15-20微升，開始準備電泳檢測和分光光度計檢測；
30、電泳檢測：4微升DEPC水+1微升6微升×LoadingBuffer+1微升樣品；
31、光度計檢測：69微升DEPC水+1微升樣品；
32、A260/A280=1.8-2.0
33、電泳結(jié)果為兩條帶：亮度為上條：下條=2條：1
34、攪拌制作注意事項固定液可以使蛋白質(zhì)變性，不再擴散，所以一定要多換一次；電泳后一定要小心取膠、固定、染色，直到干膠板，防止膠水損壞。
